microcirculationРегионарное кровообращение и микроциркуляцияRegional blood circulation and microcirculation1682-66552712-9756Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University10.24884/1682-6655-2022-21-4-58-66microcirculation-1129Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)ORIGINAL ARTICLES (EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS)Гендерные особенности реактивности сосудов микроциркуляторного русла кожи крыс по данным лазерной допплеровской флоуметрииGender specificity of reactivity rat skins microvessels according to laser doppler flowmetryЧхаидзеИ. З.ChkhaidzeI. Z.

Чхаидзе Ия Зурабовна – ассистент кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета

199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9

Chkhaidze Iya Z. – Assistant of the Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Medical Faculty

7/9, Universitetskaya embankment, Saint Petersburg, 199034

chkhaidze_i@mail.ruФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»РоссияSaint-Petersburg State UniversityRussian Federation2022271220222145866Copyright © Чхаидзе И.З., 20222022Чхаидзе И.З.Chkhaidze I.Z.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.microcirc.ru/jour/article/view/1129   Введение

   Введение. Известно, что в развитии системных нарушений микроциркуляции определенное значение имеет гендерная принадлежность. Однако особенности реактивности микрососудов и их функциональный резерв недостаточно изучены.

   Цель – изучение гендерных особенностей реактивности сосудов микроциркуляторного русла кожи крыс по данным лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) в условиях проведения функциональных проб.

   Материалы и методы

   Материалы и методы. Исследование проводили на самцах и самках крыс стока Wistar. В эксперимент отбирали самок с устойчивым 4-дневным эстральным циклом по данным кольпоцитограммы. Методом ЛДФ оценивали исходную перфузию кожи и ее динамику в условиях проведения пробы с локальной контактной гипотермией, вызванной термоэлементом. Распределение температурных полей оценивали с помощью тепловизора FLIR ONE Pro.

   Результаты

   Результаты. При контактном охлаждении кожи развивалась реакция сосудов микроциркуляторного русла, имеющая фазный характер. Сразу после воздействия локальная контактная гипотермия сопровождалась значимым снижением температуры кожи и тканевой перфузии (в зоне лазерной флоуметрии). При этом процент редукции кожного кровотока (Q %) у самцов был выше, чем у самок, и составил 54 % от исходных значений. Максимальная перфузия после восстановления кровотока отмечена на 5-й минуте у самцов, на 3-й минуте у самок и составила 147 % и 149,9 % соответственно. Исходный кровоток в микрососудах кожи в разных фазах эстрального цикла у самок статистически значимо не отличался. Однако при проведении функциональной пробы в стадии проэструса, характеризующейся максимальной секрецией эстрогенов яичниками, вазоконстрикция была менее выражена, чем в других фазах цикла.

   Заключение

   Заключение. Выявленные особенности редукции кровотока с последующей «холодовой вазодилатацией» в условиях проведения проб с локальной контактной гипотермией свидетельствуют о бóльшем функциональном резерве микрососудов и более эффективном механизме ауторегуляции системы микроциркуляции крови у самок крыс.

   Introduction

   Introduction. In the development of systemic microcirculation disorders, gender is known to have a certain significance. However, the features of the microvessels reactivity and their functional reserve have not been sufficiently studied.

   Purpose – to study the gender specificity of the microvessels reactivity of rat skin according to LDF data in the conditions of functional tests.

   Materials and methods

   Materials and methods. The study was carried out on male and female Wistar rats. Females with a stable 4-day estrous cycle according to colpocytogram data were selected for the experiment. The LDF method was used to evaluate the initial skin perfusion and its dynamics under the conditions of a test with local contact hypothermia induced by a thermoelement. The distribution of temperature fields was evaluated using a FLIR ONE Pro thermal imaging camera.

   Results

   Results. While contact cooling of the skin, microvessels developed a reaction having phase pattern. Immediately after exposure, local contact hypothermia was accompanied by a significant decrease in skin temperature and tissue perfusion (in the area of laser flowmetry). At the same time, males had higher percentage of reduction in skin blood flow (Q %) than females and amounted to 54 % of the initial values. The maximum perfusion after the restoration of blood flow was noted at the 5th minute in males, at the 3rd minute in females and amounted to 147 % and 149.9 %, respectively. The initial blood flow in the skin microvessels in different phases of the estrous cycle in females did not differ significantly. However, when conducting a functional test in the proestrus stage, characterized by the maximum secretion of estrogens by the ovaries, vasoconstriction was less pronounced than in other phases of the cycle.

   Conclusion

   Conclusion. The revealed features of blood flow reduction followed by «cold vasodilation» under conditions of local contact hypothermia tests indicate a greater functional reserve of microvessels and a more effective mechanism of autoregulation of the microcirculation system in female rats.

локальное охлаждениекожный кровотокмикроциркуляциямикрососудыреактивностькрысаэстральный цикллазерная допплеровская флоуметрияlocal coolingskin blood flowmicrocirculationmicrovesselsreactivityratestrous cyclelaser Doppler flowmetryReferencesMiller V. M., Duckles S. P. Vascular Actions of Estrogens: Functional Implications // Pharmacol. Rev. 2008; 60 (2): 210–241. Doi: 10.1124/pr.107.08002.Miller V. M., Duckles S. P. Vascular Actions of Estrogens: Functional Implications // Pharmacol. Rev. 2008; 60 (2): 210–241. Doi: 10.1124/pr.107.08002.Koh K. K. Effects of estrogen on the vascular wall: vasomotor function and inflammation // Cardiovasc. Res. 2002; 55 (4): 714–726. Doi:10.1016/s0008-6363(02)00487-x.Koh K. K. Effects of estrogen on the vascular wall: vasomotor function and inflammation // Cardiovasc. Res. 2002; 55 (4): 714–726. Doi:10.1016/s0008-6363(02)00487-x.Novella S., Pérez-Cremades D., Mompeón A., Hermenegildo C. Mechanisms underlying the influence of oestrogen on cardiovascular physiology in women // J. Physiol. 2019; 597 (19): 4873–4886. Doi:10.1113/JP278063.Novella S., Pérez-Cremades D., Mompeón A., Hermenegildo C. Mechanisms underlying the influence of oestrogen on cardiovascular physiology in women // J. Physiol. 2019; 597 (19): 4873–4886. Doi:10.1113/JP278063.Aroor A. R., De Marco V. G., Jia G., Sun Z., Nistala R., Meininger G. A., Sowers J. R. The role of tissue renin-angiotensinaldo sterone system in the development of endothelial dysfunction and arterial stiffness // Front Endocrinol. (Lausanne). 2013: 4: 161. Doi: 10.3389/fendo.2013.00161.Aroor A. R., De Marco V. G., Jia G., Sun Z., Nistala R., Meininger G. A., Sowers J. R. The role of tissue renin-angiotensinaldo sterone system in the development of endothelial dysfunction and arterial stiffness // Front Endocrinol. (Lausanne). 2013: 4: 161. Doi: 10.3389/fendo.2013.00161.Gohar E. Y., Pollock D. M. Sex-specific contributions of endothelin to hypertension // Curr Hypertens Rep. 2018; 20 (7): 58. Doi:10.1007/s11906-018-0856-0.Gohar E. Y., Pollock D. M. Sex-specific contributions of endothelin to hypertension // Curr Hypertens Rep. 2018; 20 (7): 58. Doi:10.1007/s11906-018-0856-0.Favre J., Vessieres E., Guihot A.-L., Proux C., Grimaud L., Rivron J., Garcia M. C. l., Réthoré L., Zahreddine R., Davezac M., Fébrissy C., Adlanmerini M., Loufrani L., Procaccio V., Foidart J.-M., Flouriot G., Lenfant F., Fontaine C., Arnal J.-F., Henrion D. Membrane estrogen receptor alpha (ERα) participates in flow-mediated dilation in a ligand-independent manner // Elife. 2021;(10): e68695. Doi: 10.7554/eLife.68695.Favre J., Vessieres E., Guihot A.-L., Proux C., Grimaud L., Rivron J., Garcia M. C. l., Réthoré L., Zahreddine R., Davezac M., Fébrissy C., Adlanmerini M., Loufrani L., Procaccio V., Foidart J.-M., Flouriot G., Lenfant F., Fontaine C., Arnal J.-F., Henrion D. Membrane estrogen receptor alpha (ERα) participates in flow-mediated dilation in a ligand-independent manner // Elife. 2021;(10): e68695. Doi: 10.7554/eLife.68695.Simoncini T. Mechanisms of action of estrogen receptors in vascular cells: relevance for menopause and aging // Climacteric. 2009; 12 (1): 6–11. Doi:10.1080/13697130902986385.Simoncini T. Mechanisms of action of estrogen receptors in vascular cells: relevance for menopause and aging // Climacteric. 2009; 12 (1): 6–11. Doi:10.1080/13697130902986385.Arnal J.-F., Lenfant F., Metivier R., Flouriot G., Henrion D., Adlanmerini M., Fontaine C., Gourdy P., Chambon P., Katzenellenbogen B., Katzenellenbogen J. Membrane and Nuclear Estrogen Receptor Alpha Actions: From Tissue Specificity to Medical Implications // Physiol Rev. 2017; 97 (3): 1045–1087. Doi:10.1152/physrev.00024.2016.Arnal J.-F., Lenfant F., Metivier R., Flouriot G., Henrion D., Adlanmerini M., Fontaine C., Gourdy P., Chambon P., Katzenellenbogen B., Katzenellenbogen J. Membrane and Nuclear Estrogen Receptor Alpha Actions: From Tissue Specificity to Medical Implications // Physiol Rev. 2017; 97 (3): 1045–1087. Doi:10.1152/physrev.00024.2016.Niță A.-R., Knock G. A, Heads R. J. Signalling mechanisms in the cardiovascular protective effects of estrogen: With a focus on rapid/membrane signaling // Curr Res Physiol. 2021; (4): 103–118. Doi: 10.1016/j.crphys.2021.03.003.Niță A.-R., Knock G. A, Heads R. J. Signalling mechanisms in the cardiovascular protective effects of estrogen: With a focus on rapid/membrane signaling // Curr Res Physiol. 2021; (4): 103–118. Doi: 10.1016/j.crphys.2021.03.003.Васина Е. Ю. Гендерные отличия тромборезистентности сосудистой стенки в эксперименте при фотоповреждении бедренной артерии крысы / Е. Ю. Васина, С. Г. Чефу, Н. Н. Петрищев // Регинарное кровообращение и микроциркуляция. – 2012. – Т. 11, № 3. – С. 81֪83. URL: https://www.microcirc.ru/jour/article/view/902.Vasina E. Yu., Chefu S. G., Petrishchev N. N. Gender differences in resistance to thrombosis induced in rat femoral artery by a photochemical reaction // Regional blood circulation and microcirculation. 2012; 11 (3): 81–83. (In Russ.)Kingma J. G. Jr., Laher I. Effect of endothelin on sexdependent regulation of tone in coronary resistance vessels // Biochem Biophys Res Commun. 2021; (540): 56–60. Doi: 10.1016/j.bbrc.2020.12.103.Kingma J. G. Jr., Laher I. Effect of endothelin on sexdependent regulation of tone in coronary resistance vessels // Biochem Biophys Res Commun. 2021; (540): 56–60. Doi: 10.1016/j.bbrc.2020.12.103.Hamilton K., MacKenzie A. Gender specific generation of nitroxyl (HNO) from rat endothelium // Vascul Pharmacol. 2015; (71): 208–214. Doi: 10.1016/j.vph.2015.03.004.Hamilton K., MacKenzie A. Gender specific generation of nitroxyl (HNO) from rat endothelium // Vascul Pharmacol. 2015; (71): 208–214. Doi: 10.1016/j.vph.2015.03.004.Крупаткин А. И. Лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции крови: рук. для врачей / А. И. Крупаткин, В. В. Сидоров. – М.: Медицина, 2005. – 256 с.Krupatkin A. I., Sidorov V. V. Lazernaya dopplerovskaya floumetriya mikrotsirkulyatsii krovi. Rukovodstvo dlya vrachey. Moscow, Meditsina, 2005: 256. (In Russ.)Лапитан Д. Г. Функциональное исследование системы микроциркуляции крови методом лазерной допплеровской флоуметрии в клинической медицине: проблемы и перспективы / Д. Г. Лапитан, Д. А. Рогаткин // Альм. клин. медицины. – 2016. – № 44 (2). – С. 249–259. Doi: 10.18786/2072-0505-2016-44-2-249-259.Lapitan D. G., Rogatkin D. A. Functional studies on blood microcirculation system with laser Doppler flowmetry in clinical medicine: problems and prospects // Almanac of Clinical Medicine. 2016; 44 (2): 249–259. (In Russ.)Ногеров А. Р. Половой диморфизм у белых крыс перфузии ткани и функционального состояния эндотелия микроциркуляторного русла / А. Р. Ногеров // Бюллетень мед. Интернет-конф. – 2013. – 3 (7): 1007–1009.Nogerov A. R. Sexual dimorphism of tissue perfusion and functional state of the endothelium of the microcirculatory bed in white rats // Bulletin of Medical Internet Conferences. 2013; 3 (7): 1007–1009. (In Russ.)Гурова О. А. Гендерные различия показателей ЛДФ-метрии у здоровых молодых людей / О. А. Гурова, С. М. Рыжакин // Естественные и техн. науки. – 2015. – Т. 84, № 6. – С. 176–177.Gurova O. A., Ryzhakin S. M. Gender differences in LDF metry indices in healthy young people // Natural and Technical Sciences. 2015; 6 (84): 176–177. (In Russ.)Stupin A., Stupin M., Baric L, Matic A., Kolar L., Drenjancevic I. Microvascular reactivity of young healthy subjects // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2019; 72 (4): 339–351. Doi: 10.3233/CH-180483.Stupin A., Stupin M., Baric L, Matic A., Kolar L., Drenjancevic I. Microvascular reactivity of young healthy subjects // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2019; 72 (4): 339–351. Doi: 10.3233/CH-180483.Омельяненко К. В. Гендерные особенности микроциркуляторного русла кожи у здоровых лиц трудоспособного возраста / К. В. Омельяненко [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2021. – Т. 20, № 8. – С. 3111. Doi: 10.15829/1728-8800-2021-3111.Omelyanenko K. V., Gorshkov A. Yu., Fedorovich A. A., Korolev A. I., Dadaeva V. A., Akasheva D. U., Drapkina O. M. Sex features of cutaneous microvasculature in healthy working-age people // Cardiovascular Therapy and Prevention. 2021; 20 (8): 3111. (In Russ.)Cora M. C., Kooistra L., Travlos G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse: Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears // Toxicol. Pathol. 2015; 43 (6): 776–793. Doi: 10.1177/0192623315570339.Cora M. C., Kooistra L., Travlos G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse: Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears // Toxicol. Pathol. 2015; 43 (6): 776–793. Doi: 10.1177/0192623315570339.Johnson J. M., Minson C. T., Kellogg D. L. Jr. Cutaneous Vasodilator and Vasoconstrictor Mechanisms in Temperature Regulation // Compr. Physiology. 2014; 4 (1): 33–89. Doi: 10.1002/cphy.c130015.Johnson J. M., Minson C. T., Kellogg D. L. Jr. Cutaneous Vasodilator and Vasoconstrictor Mechanisms in Temperature Regulation // Compr. Physiology. 2014; 4 (1): 33–89. Doi: 10.1002/cphy.c130015.Alba B. K., Castellani J. W., Charkoudian N. Cold-induced cutaneous vasoconstriction in humans: Function, dysfunction and the distinctly counterproductive // Exp Physiol. 2019; 104 (8): 1202–1214. Doi: 10.1113/EP087718.Alba B. K., Castellani J. W., Charkoudian N. Cold-induced cutaneous vasoconstriction in humans: Function, dysfunction and the distinctly counterproductive // Exp Physiol. 2019; 104 (8): 1202–1214. Doi: 10.1113/EP087718.Greenfield A. D. M. The circulation through the skin. In: Hamilton W. F., Dow P., editor. Handbook of Physiology, Circulation. Washington, DC: Am. Physiol. Soc., 1963.Greenfield A. D. M. The circulation through the skin. In: Hamilton W. F., Dow P., editor. Handbook of Physiology, Circulation. Washington, DC: Am. Physiol. Soc., 1963.Shepherd J. T., Rusch N. J., Vanhoutte P. M. Effect of cold on the blood vessel wall // Gen Pharmacol. 1983; 14 (1): 61–64. Doi: 10.1016/0306-3623(83)90064-2.Shepherd J. T., Rusch N. J., Vanhoutte P. M. Effect of cold on the blood vessel wall // Gen Pharmacol. 1983; 14 (1): 61–64. Doi: 10.1016/0306-3623(83)90064-2.Saumet J. L., Kellogg D. L. Jr., Taylor W. F., Johnson J. M. Cutaneous laser-Doppler flowmetry: Influence of underlying muscle blood flow // J Appl Physiol. 1988; 65 (1): 478–481. Doi: 10.1152/jappl.1988.65.1.478.Saumet J. L., Kellogg D. L. Jr., Taylor W. F., Johnson J. M. Cutaneous laser-Doppler flowmetry: Influence of underlying muscle blood flow // J Appl Physiol. 1988; 65 (1): 478–481. Doi: 10.1152/jappl.1988.65.1.478.Hodges G. J., Zhao K., Kosiba W. A., Johnson J. M. The involvement of nitric oxide in the cutaneous vasoconstrictor response to local cooling in humans // J Physiol. (London). 2006; 574 (Pt 3): 849–857. Doi: 10.1113/jphysiol.2006.109884.Hodges G. J., Zhao K., Kosiba W. A., Johnson J. M. The involvement of nitric oxide in the cutaneous vasoconstrictor response to local cooling in humans // J Physiol. (London). 2006; 574 (Pt 3): 849–857. Doi: 10.1113/jphysiol.2006.109884.Yamazaki F., Sone R., Zhao K., Alvarez G. E., Kosiba W. A., Johnson J. M. Rate dependency and role of nitric oxide in the vascular response to direct cooling in human skin // J Appl Physiol. 2006; 100 (1): 42–50. Doi: 10.1152/japplphysiol.00139.2005.Yamazaki F., Sone R., Zhao K., Alvarez G. E., Kosiba W. A., Johnson J. M. Rate dependency and role of nitric oxide in the vascular response to direct cooling in human skin // J Appl Physiol. 2006; 100 (1): 42–50. Doi: 10.1152/japplphysiol.00139.2005.Levin E. R. Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen // Mol. Endocrinol. 2005; 19 (8): 1951–1959. Doi: 10.1210/me.2004-0390.Levin E. R. Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen // Mol. Endocrinol. 2005; 19 (8): 1951–1959. Doi: 10.1210/me.2004-0390.Miller A. P., Xing D., Feng W., Fintel M., Chen Yiu-Fai, Oparil S. Aged rats lose vasoprotective and anti-inflammatory actions of estrogen in injured arteries // Menopause. 2007; 14 (2): 251–260. Doi: 10.1097/01.gme.0000235366.39726.f6.Miller A. P., Xing D., Feng W., Fintel M., Chen Yiu-Fai, Oparil S. Aged rats lose vasoprotective and anti-inflammatory actions of estrogen in injured arteries // Menopause. 2007; 14 (2): 251–260. Doi: 10.1097/01.gme.0000235366.39726.f6.Li L., Haynes M. P., Bender J. R. Plasma membrane localization and function of the estrogen receptor α variant (ER46) in human endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (8): 4807–4812. Doi: 10.1073/pnas.0831079100.Li L., Haynes M. P., Bender J. R. Plasma membrane localization and function of the estrogen receptor α variant (ER46) in human endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (8): 4807–4812. Doi: 10.1073/pnas.0831079100.Tropea T., De Francesco E. M., Rigiracciolo D., Maggiolini M., Wareing M., Osol G., Mandalà M. Pregnancy augments G protein estrogen receptor (GPER) induced vasodilation in rat uterine arteries via the nitric oxide - cGMP Signaling Pathway // PLoS One. 2015; 10 (11): e0141997. Doi: 10.1371/journal.pone.0141997.Tropea T., De Francesco E. M., Rigiracciolo D., Maggiolini M., Wareing M., Osol G., Mandalà M. Pregnancy augments G protein estrogen receptor (GPER) induced vasodilation in rat uterine arteries via the nitric oxide - cGMP Signaling Pathway // PLoS One. 2015; 10 (11): e0141997. Doi: 10.1371/journal.pone.0141997.Traupe T., Stettler C. D., Li H., Haas E., Bhattacharya I., Minotti R., Barton M. Distinct roles of estrogen receptors alpha and beta mediating acute vasodilation of epicardial coronary arteries // Hypertension. 2007; 9 (6): 1364–1370. Doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.106.081554.Traupe T., Stettler C. D., Li H., Haas E., Bhattacharya I., Minotti R., Barton M. Distinct roles of estrogen receptors alpha and beta mediating acute vasodilation of epicardial coronary arteries // Hypertension. 2007; 9 (6): 1364–1370. Doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.106.081554.Ayodeji Folorunsho Ajayi , Roland Eghoghosoa Akhigbe. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update // Fertil Res Pract. 2020; (6): 5. Doi: 10.1186/s40738-020-00074-3.Ayodeji Folorunsho Ajayi , Roland Eghoghosoa Akhigbe. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update // Fertil Res Pract. 2020; (6): 5. Doi: 10.1186/s40738-020-00074-3.Половые и возрастные различия системной воспалительной реакции при экспериментальной эндотоксинемии / А. М. Косырева [и др.] // Иммунология. ‒ 2019. – Т. 40, № 3. – С. 28–40. Doi: 10.24411/0206-4952-2019-13004.Kosyreva A. M., Makarova O. V., Mikhaylova L. P., Kakturskiy L. V. Sex and age differences of the systemic inflammatory response in experimental endotoxinemia // Immunologiya. 2019; 40 (3): 28–40. (In Russ.)Розен В. Б. Основы эндокринологии / В. Б. Розен ; под ред. д-ра биол. наук О. В. Смирновой. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 384 с.Rozen V. B. Osnovy endokrinologii / pod red. d-ra biol. nauk O. V. Smirnovoj. 3-e izd., pererab. i dop. Moscow, Izd-vo MGU, 1994: 384. (In Russ.).Чхаидзе И. З. Реактивность микрососудов брыжейки крыс в разные фазы эстрального цикла / И. З. Чхаидзе // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2005. – Т. 18, № 4. – С. 86–89.Chkhaidze I. Z. Reactivity of the mesenteric microvessels in rats in the various phases of the estrous cycle // Regional blood circulation and microcirculation. 2005; 4 (18): 86–89. (In Russ.)Dalle Lucca J. J., Adeagbo A. S., Alsip N. L. Influence of oestrous cycle and pregnancy on the reactivity of the rat mesenteric vascular bed // Hum Reprod. 2000; 15 (4): 961–968. Doi: 10.1093/humrep/15.4.961.Dalle Lucca J. J., Adeagbo A. S., Alsip N. L. Influence of oestrous cycle and pregnancy on the reactivity of the rat mesenteric vascular bed // Hum Reprod. 2000; 15 (4): 961–968. Doi: 10.1093/humrep/15.4.961.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.